Первичное выявление внутригеномной вариабельности гена 16S rRNA у культивируемых эндофитных бактерий из семян какао
First-tier detection of intragenomic 16S rRNA gene variation in culturable endophytic bacteria from cacao seeds
Argôlo-Filho, Ronaldo Costa, Marbach, Phellippe Arthur Santos, Souza, Jorge Teodoro de, Cruz-Magalhães, Valter, Silva, Cleiziane Bispo da, Santos, Hellen Ribeiro Martins dos
Аннотация (перевод)
Введение Внутригеномная вариабельность 16S rDNA является лимитирующим фактором для таксономической характеристики и оценки разнообразия Bacteria, а исследования ее встречаемости в природных/экологических популяциях немногочисленны. В данной работе прямое секвенирование ДНК-ампликонов в сочетании с рестрикционным анализом с использованием часто расщепляющих эндонуклеаз позволило быстро и эффективно выявить внутригеномную вариабельность 16S rDNA у культивируемых эндофитных бактерий из семян какао. Методы Тотальная геномная ДНК из 65 бактериальных штаммов была экстрагирована, а гипервариабельные участки V5-V9 16S rDNA были амплифицированы для ферментативного расщепления и прямого секвенирования по Сэнгеру. Полученные электроферограммы были визуально проанализированы и сопоставлены с соответствующими профилями AluI-рестрикции, а также с полными последовательностями геномов в базах данных. Рестрикционный анализ использовался для устранения необходимости клонирования ампликонов и повторного секвенирования. Специально оптимизированный градиентный электрофорез в полиакриламидном геле позволил разрешать различия в размерах рестрикционных фрагментов в 5-bp. Анализ хи-квадрат по таблице сопряженности 2x2 проверял независимость между 'количеством полос AluI' и 'типом электроферограммы'. Результаты Были получены два типа электроферограмм: уникальная матрица с одиночными пиками на основание (чистые хроматограммы) и гетерогенная матрица с различными уровнями множественных пиков на основание (смешанные хроматограммы). Статистический анализ выявил значимую взаимосвязь между количеством рестрикционных фрагментов и типом электроферограммы для одних и тех же ампликонов: чистые или смешанные ассоциировались с [less than or equal to]5 или [greater than or equal to]6 полосами соответственно. Паттерн смешанной матрицы в сочетании с профилями AluI-рестрикции показал высокую долю в 49% культивируемых эндофитов из тропической среды, демонстрирующих признаки внутригеномной гетерогенности 16S rDNA. Заключение Представленный здесь подход оказался полезным для быстрого первичного выявления внутригеномной вариабельности у культивируемых изолятов и может быть применен в исследованиях других природных популяций; предварительное представление об уровнях внутригеномной гетерогенности может дополнить культурозависимые и культуронезависимые методы. Обсуждаются последствия этих результатов для таксономических исследований и изучения разнообразия в сложных бактериальных сообществах.
Оригинальная аннотация
Background Intragenomic variability in 16S rDNA is a limiting factor for taxonomic and diversity characterization of Bacteria, and studies on its occurrence in natural/environmental populations are scarce. In this work, direct DNA amplicon sequencing coupled with frequent-cutter restriction analysis allowed detection of intragenomic 16S rDNA variation in culturable endophytic bacteria from cacao seeds in a fast and attractive manner. Methods Total genomic DNA from 65 bacterial strains was extracted and the 16S rDNA hyper variable V5-V9 regions were amplified for enzyme digestion and direct Sanger-type sequencing. The resulting electropherograms were visually inspected and compared to the corresponding AluI-restriction profiles, as well as to complete genome sequences in databases. Restriction analysis were employed to substitute the need of amplicon cloning and re-sequencing. A specifically improved polyacrylamide-gradient electrophoresis allowed to resolve 5-bp differences in restriction fragment sizes. Chi-square analysis on 2x2 contingency table tested for the independence between the 'number of AluI bands' and 'type of eletropherogram'. Results Two types of electropherograms were obtained: unique template, with single peaks per base (clean chromatograms), and heterogeneous template, with various levels of multiple peaks per base (mixed chromatograms). Statistics revealed significant interaction between number of restriction fragments and type of electropherogram for the same amplicons: clean or mixed ones associated to [less than or equal to]5 or [greater than or equal to]6 bands, respectively. The mixed-template pattern combined with the AluI-restriction profiles indicated a high proportion of 49% of the culturable endophytes from a tropical environment showing evidence of intragenomic 16S rDNA heterogeneity. Conclusion The approach presented here was useful for a rapid, first-tier detection of intragenomic variation in culturable isolates, which can be applied in studies of other natural populations; a preliminary view of intragenomic heterogeneity levels can complement culture-dependent and -independent methods. Consequences of these findings in taxonomic and diversity studies in complex bacterial communities are discussed.
Идентификаторы
Canonical: https://research.holos.house/w/0b4fbad8-9016-4016-bad9-86c2253f171b