Isolation and characterization of the genes coding for either the malate sintase and the Nrg1 repressor in Crinipellis perniciosa, an agent responsible for he witches broom on cocoa plant (Theobroma cacao)

Os genes que codificam o repressor catabólico Nrg1 e a enzima malato sintase de Crinipellis perniciosa foram clonados e caracterizados. A região codificadora do gene nrg1 possui 2121 pb e é interrompida por um íntron de 60 pb posicionado a partir da análise da seqüência de cDNA. Análises por hibridização do DNA total mostraram que o gene está presente em cópia única no genoma do fungo. A proteína deduzida apresenta dois dedos de zinco característicos de proteínas Nrg e possui 256 aminoácidos. A região 5 terminal foi seqüenciada e um potencial cis-elemento para a ligação da proteína reguladora PACC foi identificado. Foram também detectados os cis-elementos TATA box e CAAT box. A regulação da transcrição foi avaliada pela técnica de RT-PCR. O gene foi diferencialmente regulado de acordo com a concentração de glicose. A transcrição de nrg1 foi 2,1 vezes maior no micélio crescido em meio contendo glicose 0,1% do que no meio com glicose 3,0%. Em outra fonte de carbono como glicerol a transcrição foi 4,6 vezes maior do que à reportada em glicose 3,0%. A avaliação da transcrição em relação ao pH indicou uma maior transcrição em pH baixo (pH 2 e 3) do que em pH 4, 6,8 e 8. Esses resultados podem ser explicados pela presença de sítios para a proteína reguladora PacC, que é responsável pela regulação em resposta ao pH. Este é o primeiro relato da presença da proteína repressora Nrg1 em fungos filamentosos. O segundo gene estudado neste trabalho codifica a enzima malato sintase em C. perniciosa. O gene possui 1888 pb e é interrompido por cinco íntrons. Uma proteína de 539 resíduos de aminoácidos foi obtida da tradução deste gene e apresenta a seqüência característica [KR]-[DENQ]-HX(2)-G-L-N-X-W-D-Y-[LIVM]-F. Na região 5 terminal do gene malato sintase foi localizado um possível TATA box e dois possíveis sítios CAAT. A hibridização do DNA de isolados de C. perniciosa dos grupos C1, C2, C3 e C9, com o gene malato sintase, mostrou que este está presente em cópia única no genoma. Interessantemente, esta hibridização permitiu separar os isolados em dois grupos. Nos isolados C1 e C3, que foram coletados na Bahia e no Amazonas, o fragmento hibridizado possui aproximadamente 5.0 kb, mas nos isolados C2 e C9, que foram provenientes da Bahia e do Pará, corresponde a um fragmento de 4,5 kb. A transcrição do gene malato sintase foi analisada pela técnica RTPCR. A transcrição do gene foi analisada após o crescimento do micélio durante 8 dias a 27 ºC, depois este foi lavado e transferido para meio mínimo contendo acetato, isocitrato, glioxilato na presença e ausência de glicose, onde permaneceu 12 ou 24 horas. Foi observada ausência de repressão catabólica. Neste estudo também foi evidenciada a transcrição do gene malato sintase em glicerol e em extrato de polpa de cacau. O isolamento e caracterização dos genes que codificam a malato sintase e a proteína reguladora Nrg1 em C. perniciosa, junto com a disponibilidade de um sistema de transformação, permitiram a obtenção de mutantes para evidenciar os papeis das proteínas na patogenicidade.